Watching HIV bud fra celler: Undersøgelse viser sidste minuts rolle af protein ved navn ALIX

Watching HIV bud fra celler: Undersøgelse viser sidste minuts rolle af protein ved navn ALIX

Meet the Mormons Official Movie (International Version) - Full HD (Kan 2019).

Anonim

University of Utah forskere udtænkt en måde at se nydannende AIDS viruspartikler, der fremkommer eller "spirer" fra inficerede humane celler uden at forstyrre processen. Metoden viser et protein, der hedder ALIX, bliver involveret i de sidste stadier af virusreplikation, ikke tidligere, som man troede tidligere.

"Vi ser en celle ad gangen" og bruger et digitalkamera og specialmikroskop til at lave film og billeder af den spirende proces, siger virologisten Saveez Saffarian, en assisterende professor i fysik og astronomi og seniorforfatter af en ny undersøgelse af HIV-spirende udgivet online i dag i Public Library of Science journal PLOS ONE.

"Vi så ALIX rekrutteret til HIV-spirende for første gang, " siger han. "Alle vidste, at ALIX er involveret i HIV-spirende, men ingen kunne visualisere rekruttering af ALIX i processen."

Fundamentet er "grundlæggende grundforskning" og har ingen umiddelbar klinisk betydning for AIDS-patienter, fordi ALIX er involveret i for mange kritiske funktioner som celledeling som et sandsynligt mål for nye lægemidler, siger Saffarian.

"Vi ved meget om proteinerne, der hjælper HIV, komme ud af cellen, men vi ved ikke, hvordan de kommer sammen for at hjælpe viruset komme ud, og det vil være i de næste 10 til 20 år at vi vil vide meget mere om denne mekanisme, "tilføjer han. "Ville dette være et lægemiddelmål? Ville dette være en del af biokemien, der anvendes i en terapeutisk eller biotekindustri senere? Jeg kan ikke fortælle dig nu. Men hvis det ikke var på grund af vores nysgerrighed som en art, ville vi ikke have den teknologi, vi har i dag. "

Den nye undersøgelse "er godt arbejde", siger hiv-spirende ekspert Wes Sundquist, der rådede Saffarisk og er professor og medformand for biokemi ved University of Utah School of Medicine. "Det er af reel interesse for os, der studerer mekanismen for hiv-forsamling."

Undersøgelsen blev finansieret af National Science Foundation. Saffarian gennemførte undersøgelsen med første forfatter, Pei-I Ku, en universitets ph.d.-studerende i fysik; Mourad Bendjennat, en postdoktor i fysik og astronomi; tekniker Jeff Ballew; og Michael Landesman, en anden postdoktor i fysik og astronomi, der tidligere har arbejdet i Sundquists biokemi laboratorium.

Se, rør ikke, som hiv-knopper

Biokemiske metoder, der anvendes i årevis, involverer at indsamle millioner af vira i laboratorieglas og lave forskellige analyser for at afsløre proteinerne, der udgør viruset - for eksempel ved at bruge antistoffer, der binder til visse proteiner og ved hjælp af andre proteiner, der gør de første proteiner fluorescerende, så de kan ses.

"Du gør det ikke en virus ad gangen, " siger Saffarian. "Problemet med det er, at du ikke kan se forskellene mellem lignende vira. Og du kan ikke se timingen for, hvordan forskellige proteiner kommer og går for at hjælpe viruset ud af cellen."

Andre metoder fryser eller på anden måde retter celler, når nye hiv-partikler kommer ud af dem, og bruger et elektronmikroskop til at fotografere disse fryseindstillinger af virusreplikation. Saffarian bruger også teknologi kendt som "total intern refleksionsfluorescensmikroskopi", som er blevet brugt til at se på dynamiske processer i celler.

Metoden blev tidligere brugt til at lave billeder af hiv-udbredelsen og en lignende hestevirus, EIAV. Men Saffarian siger, at undersøgelsen ikke viste, at ALIX blev involveret i HIV-spirende, og havde fejl, der fejlagtigt viste, at ALIX-proteinet blev involveret ret tidligt i EIAV-spiralprocessen, hvilket tyder på, at det gjorde det samme i hiv-spirende.

Ku, Saffarian og kolleger kombinerede denne mikroskopi metode med en forbedret måde at genetisk forbinde en grøn fluorescerende "label" til ALIX proteiner i klonede celler, så de kan se proteinerne uden at skade deres normale funktion. Forskerne forsøgte adskillige såkaldte "linkers" og fandt den, der lod dem se ALIX proteinerne, da de blev involveret i HIV-spirende, men uden at forstyrre processen.

Hverken mikroskopeteknologien eller mærkning af proteiner med grøn fluorescens er nye, men "hvad vi gjorde det er nyt, er vi forbundet disse fluorescensproteiner til ALIX ved hjælp af mange forskellige slags linkere" for at finde en, der lader ALIX-proteinet fungere ordentligt, tilføjer han.

Problemet med tidligere forskning - som angav ALIX var involveret tidligt i den spirende proces - var, at kun en linker blev brugt, og det svækkede ALIX 'normale funktion, siger Saffarian.

Ser på proteiner, der danner hiv

Når HIV replikerer inde i en human celle, udgør et protein ved navn Gag de fleste af de nye partikler - der er 4.000 kopier af Gag-proteinet i en HIV-partikel - selv om en masse andre proteiner bliver involveret i processen, herunder ALIX, som står for "alg-2 interagerende protein x." Eksperimenter som dem fra Saffars hold bruger "viruslignende partikler", som er HIV-partikler, der er fjernet af deres genetiske blueprint eller genom, så de ikke udgør en infektionsrisiko i laboratoriet.

"Viruslignende partikler opretholder samme geometri og samme spirende proces som smitsom hiv, " siger Saffarian.

Under dannelse sammensætter Gag-proteiner på indersiden af ​​en cellemembran - sammen med ALIX i de sene faser - og danner en ny hiv-partikel, der skubber sin vej ud af cellen - processen hvorved AIDS i en inficeret person spredes fra celle til celle.

For at se på den spirende proces placerer Ku, Saffarian og kolleger humane HELA-celler indeholdende partiklerne i en lille mængde væskeformigt vækstmedium i en petriskål og sætter den under mikroskopet, som er i et glaskammer, der holdes ved kropstemperatur, så celler kan forblive i live i mere end 48 timer. En solid-state blå laser er rettet mod prøven for at gøre de grønnemærkede ALIX og rødmærkede Gag-proteiner glødende eller fluorescerende, så de kan ses som de samles i en viruspartikel.

Med rødmærkede Gag-proteiner og grønne mærkede ALIX-proteiner kunne vi se ALIX ved slutningen af ​​samlingen af ​​viruspartiklen "med ca. 100 ALIX-proteiner, der konvergerer med de ca. 4.000 Gag-molekyler og samles i en ny hiv-partikel. ALIX indbringer derefter to andre proteiner, som skærer den spirende viruspartikel fra cellen, når den kommer frem. ALIX 'position under klemning af nye partikler, var ikke blevet anerkendt før, siger Saffarian

Forskerne så på, at viruspartiklerne kom fra en celle ad gangen: Normalt opstod omkring 100 af dem i løbet af en to-timers periode. Saffarian siger, at de fleste af de ALIX-proteiner, der var tilbage, da HIV-samlingen var færdig og vendte tilbage til væsken inde i en celle.

Han siger, at opdagelsen, at ALIX ikke involverer, indtil de hidtidige stadier af HIV-spirende indikerer eksistensen af ​​en tidligere uigenkendt mekanisme i virussen, der regulerer timingen af ​​ALIX og andre proteiner i samling af nye HIV-partikler.

"Vi opdagede, at de cellulære komponenter, der hjælper med frigivelsen af ​​virussen, faktisk kommer i en langt mere kompleks tidsplan, end forudsagt ud fra de biokemiske data, " siger Saffarian. "Resultatet af denne undersøgelse er lovende, fordi det afslører en ny reguleringsmekanisme for rekruttering af cellulære komponenter til de hiv-spirende steder og åbner døren for spændende fremtidige undersøgelser af mekanismen for hiv-spirende."

Fysikere i virologi

Hvorfor studerer fysikere virus? For det første studerer biofysikere fysiske mekanismer i biologi, såsom motorer i celler. Saffarian har fået en doktorgrad i biofysik, der udviklede metoder, der brugte fluorescerende lys til at se på cellulære processer.

"Jeg blev meget jaloux, fordi jeg følte hver gang jeg bidrog til et projekt, var den faktiske videnskab en andens udøvelse, " siger han. "Jeg hjalp dem med værktøjer, men jeg spurgte mig heller ikke grundlæggende spørgsmål."

Så Saffarian gjorde et postdoktoralt fællesskab i cellebiologi på Harvard Medical School, så "besluttede jeg at studere vira, hvordan de kommer ud af celler og replikerer." Udover sin stilling i fysik er han adjungeret biologisk assistent professor.